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【科普】叶绿素荧光传感器原理

发布人:rxzhang 来源: 发布时间:2021-03-22 16:02:49
研究背景:
目前测量叶绿素浓度的方法有很多,可分为现场测量与实验室测量。现场测量主要是使用叶绿素荧光传感器来测量叶绿素浓度;实验室测量主要有荧光法、分光光度法以及液相色谱法等等,其中荧光法是使用较为广泛的一种实验室内测量叶绿素浓度的方法。现场测量优点是测量方便,可快速得到数据,无化学试剂,不存在二次污染,并且是在不干扰叶绿素生存环境状态下进行原位测量,缺点是易受其他荧光物质以及背景光的影响,数据存在一定误差;实验室测量较为繁琐复杂,但是数据准确度相对较高。
叶绿素荧光现象是由传教士Brewster首次发现的。1834年Brewster发现,当一束强太阳光穿过月桂叶子的乙醇提取液时,溶液的颜色变成了绿色的互补色——红色,而且颜色随溶液的厚度而变化,这是历史上对叶绿素荧光及其重吸收现象的首次记载。后来,Stokes(1852)认识到这是一种光发射现象,并使用了“fluorescence”一词。
叶绿素荧光现象:叶绿素提取液在透射光下呈绿色,在反射光下呈红色
为什么会产生叶绿素荧光现象?
叶绿素对于可见光(380-760nm)中的蓝紫光和红光具有很强的吸收,当一束光透过叶绿素时,所有的蓝紫光和红光被吸收,只剩下绿光进入我们的眼睛,所以叶绿素提取液在透射光下呈现绿色;当一束光照射叶绿素提取液时,叶绿素吸收蓝紫光和红光后,产生红色波段荧光,因此在反射光部分会观察到叶绿素提取液呈现红色。那么在自然状态下为什么植物叶片不是红色的?因为自然状态下绝大部份的光能都被用来做光合作用,产生的荧光可忽略不计
 
叶绿素吸收蓝紫光和红光
叶绿素产生的荧光处于红光区
荧光是如何产生的?
叶绿素在光照下吸收蓝紫光和红光,叶绿素分子从基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)。由于波长越短能量越高,故叶绿素分子吸收红光后,电子跃迁到最低激发态;吸收蓝光后,电子跃迁到比吸收红光更高的能级(较高激发态)。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定,在几百飞秒(fs,1 fs=10-15 s)内,通过振动弛豫向周围环境辐射热量,回到最低激发态。最低激发态的叶绿素分子可以稳定存在几纳秒(ns,1 ns=10-9 s)。处于较低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径释放能量回到稳定的基态。能量的释放方式有如下几种(Campbell et al.,1998;Roháček & Barták,1999;Malkin & Niyogi,2000):1、重新放出一个光子,回到基态,即产生荧光。由于部分激发能在放出荧光光子之前以热的形式逸散掉了,因此荧光的波长比吸收光的波长长,叶绿素荧光一般位于红光区。2、不放出光子,直接以热的形式耗散掉(非辐射能量耗散)。3、将能量从一个叶绿素分子传递到邻近的另一个叶绿素分子,能量在一系列叶绿素分子之间传递,最后到达反应中心,反应中心叶绿素分子通过电荷分离将能量传递给电子受体,从而进行光化学反应(光合作用)。
荧光产生过程
UniLux叶绿素荧光传感器原理:
叶绿素的荧光值大小与叶绿素的浓度成正比关系,两者之间的具体相关关系则需要进行实验室校准。UniLux叶绿素荧光传感器使用蓝光430nm作为中心发射光源,使用685nm作为中心检测波长。通过去离子水校准其背景值,100ug/l叶绿素丙酮提取液作为高值校准。从而得到叶绿素荧光和浓度之间的具体计算公式,实际应用中将检测到的荧光值代入公式,即可得到叶绿素浓度:
上式中:
Concentration为检测的叶绿素浓度
Signal为仪器实际接收到的信号
Ref为仪器内部参比值
Gain为校准中得到的参数
Offset为基线背景值校准得到的参数
需要注意的是,实验室内使用的叶绿素标准溶液与自然环境中的浮游植物,它们对光的吸收波宽以及发射的荧光宽度都有不同之处。因此,在实际测量中不可避免会出现误差。另外,校准时的环境温度等等都会对结果有所影响。较好的处理方法是在实际现场中,使用需要测量的浮游植物已知浓度溶液来作校准,这样得到的结果会大大增加准确性。当然,随之也会增加很大的人力和成本。
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